植物基因組中有多種多樣的調(diào)控元件、功能基序以及非編碼DNA，例如啟動子順式作用元件、miRNA編碼序列、具有調(diào)控功能的基因間區(qū)。這些DNA序列在調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄翻譯等方面發(fā)揮重要作用，也是目前基因功能研究與遺傳改良的重點(diǎn)目標(biāo)區(qū)域。基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于功能基因研究和作物遺傳改良。由sgRNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶可以在基因組靶位點(diǎn)處產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，細(xì)胞通過非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)，往往容易形成1~3個核苷酸的插入或缺失突變。然而，這種插入/缺失突變很難有效地破壞調(diào)控DNA的功能，因此經(jīng)典的CRISPR/Cas9不能有效對上述重要DNA功能元件進(jìn)行操縱。基于此，開發(fā)新型、精準(zhǔn)、可預(yù)測的多核苷酸刪除基因組編輯系統(tǒng)對調(diào)控DNA序列的功能解析及應(yīng)用具有重要意義。
 

　　中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組長期致力于植物基因組編輯新技術(shù)的研究和開發(fā)。最近，該研究組基于胞嘧啶脫氨以及堿基切除修復(fù)(BER)原理，首次將野生型SpCas9與胞嘧啶脫氨酶APOBEC、尿嘧啶糖基化酶(UDG)以及無嘌呤嘧啶位點(diǎn)裂合酶(AP lyase)組合，建立了新型的多核苷酸靶向刪除系統(tǒng)(AFIDs)，并成功在水稻和小麥基因組中實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)、可預(yù)測的多核苷酸刪除。考慮植物細(xì)胞本身存在BER體系，該研究組首先利用高脫氨活性的APOBEC3A脫氨酶構(gòu)建出3種形式的AFID系統(tǒng)(AFID-1~3)，并在水稻和小麥細(xì)胞中對多個內(nèi)源DNA靶點(diǎn)進(jìn)行測試，結(jié)果顯示AFID-3介導(dǎo)的刪除效率高達(dá)33.1%，且產(chǎn)生從不同的5’-胞嘧啶到Cas9切割位點(diǎn)間的多核苷酸刪除，可預(yù)測的刪除比例高達(dá)30%以上。研究人員進(jìn)一步對不同胞嘧啶脫氨酶進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)截斷的APOBEC3B脫氨酶(A3Bctd)不僅有較高的脫氨活性，同時還具有一個更窄的脫氨窗口。研究人員將A3Bctd替換AFID-3系統(tǒng)中的A3A，從而開發(fā)出eAFID-3系統(tǒng)。eAFID-3更高效地介導(dǎo)從偏好TC基序的脫氨位點(diǎn)到Cas9 切割位點(diǎn)之間的可預(yù)測刪除，效率是AFID-3的1.5倍。此外，研究組利用AFID-3系統(tǒng)靶向水稻OsSWEET14基因啟動子上的效應(yīng)子結(jié)合元件，獲得了多核苷酸刪除的突變體植株。經(jīng)白葉枯病接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相較于1~2 bp的插入缺失，該系統(tǒng)產(chǎn)生的多核苷酸刪除水稻突變體對白葉枯病菌的抗性更強(qiáng)。
 

　　AFID系統(tǒng)具有高效、精準(zhǔn)、可預(yù)測等優(yōu)勢，因此該系統(tǒng)的建立可為植物基因組調(diào)控DNA的功能研究及設(shè)計育種提供了一個強(qiáng)有力的基因組編輯工具。該研究成果于6月29日在線發(fā)表于Nature Biotechnology上(DOI:10.1038/s41587-020-0566-4)。高彩霞研究組博士后王升星、博士后宗媛、博士生林秋鵬和副研究員張華偉為該論文的共同第一作者，高彩霞為該論文通訊作者。中科院微生物研究所邱金龍研究組也參與了研究工作。該研究得到中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、國家轉(zhuǎn)基因重大科技專項(xiàng)、國家自然科學(xué)基金委項(xiàng)目的資助。