近日，南方科技大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系張博副教授課題組在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《水研究》(Water Research)發(fā)表題為“Tunable Surface Potential Nanomaterials for Enhanced Environmental Nucleic Acid Extraction and Surveillance”的研究論文，介紹了一種基于表面電位可調(diào)材料(tunable surface potential magnetic nanoparticles, TPMP)的高效核酸富集方法，可在1小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)水樣本中90%的DNA/RNA回收，針對(duì)環(huán)境水樣本中不同形式核酸(如游離DNA、游離RNA、胞內(nèi)核酸、病毒核酸等)均有優(yōu)異的提取能力。該技術(shù)具有快速高效、可復(fù)用、低成本等特點(diǎn)，在環(huán)境核酸監(jiān)測(cè)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
 

　　環(huán)境核酸(eNA)是指生物釋放到環(huán)境中的DNA/RNA，蘊(yùn)含豐富的生物信息?；谒h(huán)境eNA的技術(shù)具有非侵入性、采樣便捷、信息量大等優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究、人類(lèi)或動(dòng)物病原體監(jiān)測(cè)以及環(huán)境污染溯源等領(lǐng)域，在保護(hù)環(huán)境和公共衛(wèi)生方面展現(xiàn)出巨大潛力，并為相關(guān)管理政策制定提供依據(jù)。與此同時(shí)，響應(yīng)型的環(huán)境管理政策需要持續(xù)獲取環(huán)境中的實(shí)時(shí)信息反饋，這要求對(duì)eNA進(jìn)行大規(guī)模、高頻率的分析檢測(cè)，因而亟需操作簡(jiǎn)便、成本低廉、高效可靠的eNA分析技術(shù)。
 

　　圖1 TPMP方法提取能夠從多種環(huán)境水樣中提取胞內(nèi)核酸和胞外核酸，助力環(huán)境核酸在多種場(chǎng)景下的應(yīng)用
 

　　然而，樣本體積大、eNA濃度低以及eNA存在形態(tài)多樣等特點(diǎn)對(duì)當(dāng)前環(huán)境核酸提取技術(shù)而言充滿(mǎn)了挑戰(zhàn)性。常用核酸提取方法如乙醇沉淀法、離心柱法、傳統(tǒng)磁性法因成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，不適用于大體積環(huán)境水樣中的eNA提取。
 

　　目前最常用的水環(huán)境eNA提取方法是膜過(guò)濾法，通過(guò)0.2微米孔徑濾膜捕獲水樣中的完整細(xì)胞，然而大量胞外eNA(e-eNA)——包括游離eNA及病毒eNA——會(huì)通過(guò)濾膜進(jìn)入濾液中。研究表明e-eNA攜帶重要生物信息，包括微生物群落結(jié)構(gòu)和抗生素抗性基因(ARG)等功能特征。濾膜法對(duì)e-eNA的回收率較低，導(dǎo)致關(guān)鍵生物信息缺失，限制了其在水傳播病毒監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。e-eNA因分子量小、濃度低等特點(diǎn)導(dǎo)致其富集更為困難?，F(xiàn)有e-eNA富集方法包括化學(xué)沉淀法、超速離心法、超濾法以及柱吸附-沉淀聯(lián)用法，均存在操作復(fù)雜、依賴(lài)昂貴專(zhuān)用設(shè)備、難以規(guī)?；葐?wèn)題。
 

　　針對(duì)實(shí)際應(yīng)用需求，項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了基于表面電位可調(diào)磁性納米粒子(TPMP)的水環(huán)境eNA提取方法，可在60分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)水中90%的核酸回收率及100-1000倍富集效果。該方法對(duì)不同片段長(zhǎng)度的游離DNA/RNA、胞內(nèi)核酸及病毒核酸等不同種類(lèi)核酸均具有高效回收能力。對(duì)五類(lèi)真實(shí)水樣的環(huán)境DNA(eDNA)提取實(shí)驗(yàn)證明，相比常規(guī)方法，該技術(shù)對(duì)eNA的回收產(chǎn)率提升了1.2-11.8倍，耗時(shí)從數(shù)小時(shí)縮短至60分鐘以?xún)?nèi)，并且TPMP材料可循環(huán)使用多次且保持性能穩(wěn)定。
 

　　圖2 TPMP材料的合成與表征 a)TPMP的設(shè)計(jì)原理；b)氨基及不同金屬配體修飾的磁性納米粒子示意圖；c)修飾后納米粒子的傅里葉變換紅外光譜；d)不同pH條件下與金屬離子孵育前后的納米粒子的Zeta電位變化
 

　　圖3 基于TPMP的核酸提取方法性能評(píng)估 a) TPMP方法的流程；b-e)通過(guò)qPCR/RT-qPCR技術(shù)對(duì)初始溶液、上清液和洗脫液中游離RNA(b)、大腸桿菌(c)、DNA病毒(d)及RNA病毒(e)濃度的檢測(cè)；f)初始溶液、上清液與洗脫液中DNA片段的凝膠電泳分析；g-h)TPMP與大腸桿菌(g)及DNA病毒(h)孵育后的掃描電鏡圖像；i-j)TPMP對(duì)DNA/RNA的吸附能力(i)與洗脫效率(j)；k)8HQ-MP表面電位切換過(guò)程示意圖；l-m)切換過(guò)程中的表面元素(l)與Zeta電位(m)分析
 

　　此外，TPMP方法對(duì)胞外eNA(e-eNA)的高效提取幫助揭示其中常被忽視的生物信息與應(yīng)用價(jià)值。本研究通過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，e-eNA包含在環(huán)境壓力下裂解的微生物信息，與細(xì)胞內(nèi)eNA(i-eNA)的微生物組成具有差異顯著，還包含從裂解宿主中釋放的病毒的生物信息，為病毒-宿主相互作用研究提供更全面的數(shù)據(jù)支撐。更重要的是，高風(fēng)險(xiǎn)ARG(如病毒與病原體相關(guān)ARG)在e-eNA中高度富集，凸顯其監(jiān)測(cè)的重要性?；谠摲椒ń?jīng)濟(jì)高效、簡(jiǎn)單快速的優(yōu)勢(shì)，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)常態(tài)化環(huán)境監(jiān)測(cè)平臺(tái)，成功追蹤ARG熱點(diǎn)區(qū)域的基線(xiàn)水平與季節(jié)性波動(dòng)規(guī)律。這些結(jié)果表明TPMP方法能夠滿(mǎn)足eNA分析日益增長(zhǎng)的需求，可拓展應(yīng)用于生態(tài)調(diào)查、e-eNA研究、ARG及病原體篩查和常態(tài)化環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。
 

　　圖4 基于細(xì)胞內(nèi)外eDNA的病毒-宿主分析(MF：濾膜法過(guò)濾水樣中的完整細(xì)胞中的核酸，主要為胞內(nèi)核酸；F-TPMP：用TPMP提取濾液中的核酸，主要為胞外核酸；TPMP：用TPMP法提取水樣中的核酸，包含胞內(nèi)核酸和胞外核酸)；a)各測(cè)序樣本中病毒分類(lèi)操作單元(vOTU)種類(lèi)和數(shù)量(LW：湖水樣本，SW：海水樣本，TPE：污水處理廠(chǎng)出水樣本)；b) 各測(cè)序樣本中宏基因組組裝基因組(MAG)種類(lèi)和數(shù)量；c-d)不同方法提取樣本中病毒和細(xì)菌讀段(reads)數(shù)量的比較(*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001)；e)湖水中預(yù)測(cè)病毒-宿主互作關(guān)系的沖積圖：左側(cè)色帶連接病毒富集方法與病毒分類(lèi)單元，右側(cè)色帶連接病毒與其預(yù)測(cè)宿主
 

　　圖5 基于TPMP方法的抗生素抗性基因(ARG)常規(guī)監(jiān)測(cè) a)水環(huán)境ARG監(jiān)測(cè)流程；b-c)采樣點(diǎn)地理空間分布：(b)污水處理廠(chǎng)出水排放點(diǎn)及(c)校園內(nèi)四個(gè)景觀水體采樣點(diǎn)；d-e)膜過(guò)濾法(MF)與TPMP法在(d)污水處理廠(chǎng)出水排放點(diǎn)及(e)景觀水體采樣點(diǎn)的ARG分析結(jié)果對(duì)比；f-j)采樣點(diǎn)1(f)、2(g)、3(h)、4(i)和5(j)的ARG長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)
 

　　論文共同第一作者為南方科技大學(xué)2022級(jí)博士生呂嘉暉、2023級(jí)碩士生李彤和南方科技大學(xué)研究助理教授劉瑩，張博、廣州醫(yī)科大學(xué)教授邵攀霖為論文通訊作者，南方科技大學(xué)為論文第一單位，合作單位為廣州醫(yī)科大學(xué)、清華大學(xué)深圳研究生院以及深圳技術(shù)大學(xué)。以上研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金、廣東省先進(jìn)生物材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目的支持。